iCubate生物技术平台的核心技术是 arm-PCR (amplicon rescued multiplex PCR, patent pending) 多重扩增专利技术。

   从八十年代 Kerry Mullis 博士发明PCR开始,科学家们就试图做多重反应:在一个反应体系里面扩增多个分子靶点。可是多重很难做,有三个主要原因:(1)靶点不兼容。扩增一个靶分子的一对引物通常不能和另一对引物共用一个最佳反应条件。引物越多,反应越难优化,一般超过五个靶点就很难了;(2)扩增背景过高。因为每对引物都有一个为了检测用的标记,引物之间的非特异性反应就会产生除很多背景;(3)可重复性差。因为引物合成纯化程度不同,每一批引物反应条件都可能不同,因此产品经常不稳定,好不容易优化好了一个多重反应体系,试剂用完后再合成,结果又变得不确定了。

  上面提到的第一个难题(不兼容)使得多重PCR为基础的分子鉴别诊断试剂研发非常困难;第二个难题(高背景)使得自动化非常困难;而第三个难题(难重复)使得报批很难。因为有这三个难点,分子鉴别诊断的产业化就迟迟没能实现。

  另一个多重扩增技术tem-PCR解决了上述三个主要难题。如图所示,针对每个要共同扩增的靶点,tem-PCR 要求设计两对,巢式引物,Fo是外面前向引物,Fi是里面前向引物,Ro是外围反向引物, Ri是内部反向引物。内部引物(Fi, Ri)有一个所有靶点都共用的“尾巴”,这个共用区可以被另一对“超级引物” (SuperPrimer) 所识别杂交。反向超级引物(RS)上面带有生物素标记,产生出的产物可以通过介于引物之间的杂交检测探针(Detection Probe) 识别。设立PCR反应的时候,所有巢式引物和超级引物都一同进入反应体系,但是那些基因特异性的巢式引物的浓度非常非常低,只有超级引物的浓度是够用来做指数增长扩增的。反向超级引物的浓度还比正向高四倍,这样非对称PCR反应的结果就是体系内大量单链DNA, 便于杂交检测。

                         

tem-PCR 成功地解决了靶点不兼容的问题。因为如果做常规多重PCR, 假设要扩增十个靶点,每个靶点的引物都再规定的退火温度下都很难达到最佳反应状态。利用巢式引物,因为内外交替有四个排列组合机会(Fo/Ro, Fo/Ri, Fi/Ro, Fi/Ri) ,因此,再任何一个给定的退火温度条件下,对某一个靶点来讲,都有四个形成产物的机会。这样就解决了靶点不兼容的问题。

   tem-PCR也解决了高背景的问题。因为如果用常规PCR, 每个靶点都需要有一个引物带有生物素标记,这样引物之间的结合就可能产生背景。用tem-PCR 整个反应体系里面仅有一个带有标记的引物(RS)所以那些由引物之间相互作用产生出的产物因为没有标记而不被检测。

  最后,可重复性差的问题也得到了很好的解决。因为巢式引物的浓度非常低,一次生产可以使用很久,这就避免了批间差的问题,使产品更加稳定。

  tem-PCR 还有另一个附加的好处,就是它是半定量的。因为所有共同扩增的靶点都是通过超级引物达到指数增长扩增的,反应效率都是一样的,因此,即使是反应终点进行分析,各靶点之间的比例关系还是保持相对不变的。这个半定量的特点对遗传病(基因拷贝数,缺失等)的研究,感染性疾病的主要和次要感染源的识别等都非常重要。
下表列出一系列用tem-PCR技术开发出来的临床分子鉴别诊断产品和对该产品进行临床验证的有关论文。 
Panel name  Detected pathogens  Publications 
ResPlex I (The bacteria panel)   Mycoplasma pneumoniae, Leginella pneu-mophila, Chlamydia pneumoniae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae  Direct Screening of Clinical Specimens for Multiple Respiratory Pathogens Using the Genaco Respiratory Panels 1 and 2. Diagn Mol Pathol. 2006. 15(3): 169. Brun-stein & Thomas. Development and Evaluation of a Novel Multiplex PCR Technology for Molecu-lar Differential Detection of Bacterial Respiratory Disease Pathogens. Journal of Clinical Microbiology. 2008. 46(6): 2074. Benson et al.  
ResPlex II (The viral panel)   Adenoviruses, Influenza A, Influenza B, Respiratory syncytial virus A and B, Parainfluenza virus types 1-4, Human metapneumovirus, Rhinoviruses, Cox-sackie viruses, Echoviruses  Simultaneous Detection and High-throughput Identification of a Panel of RNA Viruses Causing Respiratory Tract Infections. Journal of Clinical Microbiology. 2007. 45(7): 2105. Haijing Li et al., Evidence from Multiplex Molecular Assays for Complex Multipathogen Interac-tions in Acute Respiratory Infections. Journal of Clinical Microbiology, 2008. 46(1): 97. Brunstein et al.  
ResPlex III (Influenza typing)  H1, H2, H3, H5, H7, H9, N1, N2, NS-A, NS-B.  Human influenza A virus (H5N1) detection by a novel multiplex PCR typing method. Journal of Clinical Microbiology. 2007. 45(6):1889. Zhou et al. 
StaphPlex (CoNS, MR-CoNS, MSSA, MRSA)   S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. simulans, S. aureus, Methicillin resistance, Community Acquired MRSA, Hospital Acquired MRSA, Aminoglycoside resistance, MLS resistance and Tetracycline resistance.  StaphPlex System for Rapid and Simultaneous Identification of Antibiotic Resis-tance Determinants and Panton-Valentine Leukocidin Detection of Staphylococci from Positive Blood Cultures. Journal of Clinical Microbiology. June 2007, 45(6): 1867. Staphylococcus pseudolugdunensis sp. Nov., a pyrrolidonyl arylami-dase/ornithine decarboxylase-positive bacterium isolated from blood cultures. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2008, 60:351  
MVPlex (CoNS, MR-CoNS, MSSA, MRSA, VSE, VRE)   S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. simulans, S. aureus (methicillin sensitive or methicillin resis-tant), Vancomycin sensitive or resistant Enterococcus.  MVPlex Assay for Direct Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus from Nares and other Swab Specimens. Journal of Clinical Microbiology. 2008. 46(9): 3107. Podzorski et al. 
HPV panel  25 subtypes of HPV  Simultaneous Ampli?cation and Identi?cation of 25 Human Papillomavirus Types with Templex Technology. Journal of Clinical Microbiology. Nov. 2006. 44(11): 4157. Han et al. 
TB drug resistance  25 mutations related to resistance to four front line drugs: Isoniazid, Rifampin, Streptomycin, Ethambutol.  Prevalence of and Molecular Basis for Tuberculosis Drug Resistance in the Re-public of Georgia: Validation of a QIAplex System for Detection of Drug Resis-tance-Related Mutations. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2008. 52(2):725. Gegia et al. 

   虽然tem-PCR 是一个很好的多重扩增技术,但是它还有一些缺陷。比如说在使用这个tem-PCR/xMAP 产品组合的时候发现它有如下缺点: (1)分析敏感度不够高。用同一个模板比例稀释,然后比较一般实时PCR 和 tem-PCR, 后者的敏感性仅是前者的百分之一;(2)使用不方便。整个PCR反应的设立,杂交反应的设立,液态芯片仪器的设立都还很复杂,需要专门培训的高级实验室操作人员做实验。(3) 时间过长。因为引物浓度低,为了提高扩增效率,每个周期都给很常的时间。(4)开放体系。这是最“头痛”的问题,客户希望设法避免开放体系带来的污染危险。

  为了解决上述问题,我们研发了arm-PCR多重扩增专利技术,首先要解决的是敏感性不够高和反应时间过长的问题。这些问题的产生原因是tem-PCR里面巢式引物的浓度太低。和任何酶反应一样,PCR反应时,如果底物(引物)浓度低,那反应效率就一定很差。所以arm-PCR (如图所示)的巢式引物浓度大大提高了。但是,arm-PCR与tem-PCR 的一个显著差别就是共用引物(tem-PCR 里面的超级引物)不和巢式引物一起进入反应。在第一轮反应结束以后,用物理的方法把引物去掉,把第一轮扩增出的产物回收回来,然后再加入共用引物和新鲜的酶等试剂,再进行一轮指数增长式的扩增。这样,arm-PCR的敏感性与tem-PCR 比增加了一百倍,时间也缩短了两个小时。
 
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